Quelle colonne HPLC choisir pour l’analyse et/ou la caractérisation de vos Biomolécules ?

L’utilisation importante des Biomolécules dans l’élaboration des traitements modernes entraine de nouvelles problématiques pour l’analyse et/ou la caractérisation de protéines intactes, d’anticorps monoclonaux (Mabs), de Biosimilaires, de conjugés d’anticorps-médicaments ( ADCs antibody drug conjugates), de Peptides thérapeutiques, de Biomarqueurs, de glycans (N- et O-liés aux glycoprotéines).

L’analyse et/ou la caractérisation par HPLC de ces Biomolécules est un domaine très spécifique et très différent de celui de l’analyse de petites molécules : les règles chromatographiques utilisées sont différentes.
La taille, la polarité et la conformation des analytes étant très variées, il est nécessaire d’utiliser des supports chromatographiques adaptés, très performants, pour conduire à des analyses rapides et très résolutives.
Le choix de la porosité est crucial pour éviter les problèmes d’exclusion, alors que le dimensionnement de la colonne (taille de particule, longueur, diamètre) conditionnera la durée globale de l’analyse.
Pour obtenir une bonne séparation, le greffage de l’adsorbant et le développement de conditions chromatographiques optimales (solvants, additifs, débit, température, pente de gradient, …) jouent un rôle majeur et conduisent à une bonne sélectivité et une importante capacité de pics.
La performance d’un système HPLC contribue aussi à la réussite de ce type de chromatographie mais ne doit pas être un facteur limitant pour les analystes.
Pour l’analyse en Peptide Mapping (après digestion enzymatique de protéines) ou de fragments de chaines lourdes ou légères d’anticorps monoclonaux, l’utilisation d’un couplage LC/MS apporte un niveau de précision très élevé sur leurs structures.

 

1. Pourquoi les colonnes HPLC AMT Halo BioClass sont les solutions les plus innovantes pour l’analyse des biomolécules.

AMT (Advanced Materials Technology) est le leader mondial dans la fabrication de Silice Core Shell, aussi appelé silice Fused-Core ou silice partiellement poreuse et propose :

 

a. Une large gamme de tailles de particules pour l’analyse de toutes vos Biomolécules : Halo BioClass disponibles en 2µm ; 2.7µm ; 3.4µm ; 5µm

Particules de silices AMT Halo BioClass

b. Des tailles de porosités adaptées à la diversité de toutes les Biomolécules : 90Å, 160Å, 400Å, 1000Å

Guide de sélection pour choisir sa porosité :

Marque	Porosité	Taille particule	Surface spécifique	Greffage	Analytes
HALO Glycan	90Å	2.7µm	135m2/g	Propriétaire	Glycans, glycopeptides, glycoprotéines < 20kDa
HALO Peptide	160Å	2 ; 2.7 ; 5µm	65 ; 90 ; 60m2/g	ES-C18, ES-CN, Phényle-Hexyle	Peptides et polypeptides 10Da < MW < 15kDa
HALO Protein	400Å	3.4µm	15m2/g	C4, ES-C18	Peptides, polypeptides et protéines 2kDa < MW < 500kDa
HALO Protein	1000Å	2.7µm	22m2/g	C4, ES-C18, Diphényle	Grosses protéines, fragments (Mabs & ADCs) > 50kDa

 

c. 5 chimies de greffage pour modifier la sélectivité de vos séparations lors de développements de méthodes

Comparatif de sélectivité pour l’analyse de Peptides

Colonnes HPLC Halo 160Å 2.7µm, greffées ES-CN, ES-C18, Phenyl/Hexyl

	Conditions de test : Colonne Halo 2.7µm 100×2.1mm Phase mobile : A : H20 avec 10mM de DFA (acide Difluoroacétique, B : ACN+10mM DFA Débit : 0.3mL/min Gradient : de 2 à 50% B en 60min Temp. : 60°C – UV 220nm Vol. injection : 5μL d’une solution digérée à 0.2mg/mL Instrument: Shimadzu Nexera
Solvant d’échantillon : solution à 50mM Tris-HCl/1.5M Guanidine-HCl avec 0.25% d’acide formique Composés : 1. FTISADTSKNTAYLQMNSLR (754m/z) I 2. LScAASGFNIKDTYIHWVR (747m/z) I 3. GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK (849m/z) I 4. LLIYSASFLYSGVPSR (592m/z) I 5. SGTASVVcLLNNFYPR (899m/z) I 6. ScDKTHTcPPcPAPELLGGPSVFLFPPKPK (834m/z) I 7.VVSVLTVLHQDWLNGKEYK (1115m/z)

 

Comparatif de sélectivité pour l’analyse de Protéines (Mabs)

Conditions de test : Colonnes HPLC Halo 1000Å 2.7µm, greffées ES-C18, C4, diphényle vs colonne silice totalement poreuse 300Å 1.7µm C4 Phase mobile : A : H20/0.1% TFA B : ACN/0.1% TFA Débit : 0.4mL/min Temp. : 40°C Vol. injection : 2μL Instrument: Shimadzu Nexera Détection : PDA à 280nm

 

d. Disponibilté des colonnes HPLC aux formats : analytiques (ø interne de 4.6 ; 3 ; 2.1mm ) micro & nano (ø interne de 1mm à 50µm)

 

2. Pourquoi utiliser des silices Core Shell AMT Halo pour l’analyse et la caractérisation de Biomolécules ?

a. Pour une accessibilité optimale des pores de la silice

Caractérisation & analyse d’anticorps monoclonaux

Comparatif d’une colonne sur silice Core Shell AMT Halo 1000Å 2.7µm C4 vs une colonne sur silice totalement poreuse 300Å 1.7µm C4

Conditions de test : Colonne : HALO 1000Å C4, 2.7μm, 2.1x150mm Phase mobile : A : 88/10/2 H20/ACN/n-propanol/0.1% DFA B : 70/20/10 n-propanol/ACN/water/0.1% DFA Gradient : 14-24% B en 20min Débit : 0.2 mL/min Temp. : 80°C Injection : 2μL à 2mg/mL Instrument: Shimadzu Nexera Détection : PDA à 280nm Identités des pics 1. IgG2-B, 2. IgG2-B, 2b. IgG2-B, 3. IgG2-A/B, 4. IgG2-A/B, 5. IgG2-A, 6. IgG2-A

 

Caractérisation du Trastuzumab (Mab) – forme intacte non dénaturée

Comparatif d’une colonne sur silice Core Shell AMT Halo 1000Å C4 vs une colonne sur polymère 1500Å

Conditions de test : Colonnes : 1000Å SPP & 1500Å FPP 2.1x100mm Phase mobile : A : H20 (0.1% TFA) B : 80/20 ACN/EAU (0.085% TFA) Gradient : 40-47.5% B en 8min Débit : 0.4mL/min Temp. : 80°C Injection : 2μL à 2mg/mL Instrument: Shimadzu Nexera Détection : UV à 280nm

 

b. Pour un transfert de matière plus rapide

Analyse ultra rapide de Peptides sur colonne Core Shell AMT Halo 160Å ES-C18 2µm

Conditions de test : Colonnes : Halo 2.0µm Peptide ES-C18 50×3.0mm Phase mobile : A : H20 avec 0.1% TFA B : H20 avec 0.1% TFA dans 80/20 ACN / H20 Gradient : maintenir à 12.5% Débit : 2.2mL/min I Temp. : 60°C – UV 215nm, PDA Vol. injection : 0,5μL Système : Shimadzu Nexera X2 Temps de réponse : 0.025 sec. Data Rate : 200Hz I Flow Cell : 1μL

 

c. Pour une meilleure efficacité chromatographique

Séparation en phase inverse d’un mélange de protéines intactes sur colonne Core Shell AMT Halo 1000Å ES-C18 2.7µm

Condition du test Colonne : HALO 1000 Å ES-C18, 2.7μm, 2.1x150mm Phase mobile A : H2O (0.1% TFA) Phase mobile B : 80/20 ACN/H2O/0.085% TFA Gradient : 27-60 %B in 15min Débit : 0.4mL/min I Température : 60°C I Détection : UV à 280nm Volume d’injection : 2µL Système : Shimadzu Nexera XREchantillons : 1. ribonucléase A I 2. lysozyme I 3. SigmaMAb I 4. α-lactalbumin I 5. énolase

 

d. Pour une capacité de pics accrue

Séparation de N-linked Glycan à partir d’immunoglobuline humaine ( IgG) sur colonne Core Shell AMT Halo 90Å Glycan 2.7µm

Condition du test Colonne : HALO 2.7µm Glycan – 2,1x150mm Phase mobile A : 50mM Ammonium Formate, pH 4.4 Phase mobile B : Acétonitrile Gradient : 77.5 – 60% B in 60min Débit : 0.5mL/min Température : 60°C Détection : UV 280nm Volume d’injection : 4µL Système LC : Shimadzu Nexera MS : Shimadzu LCMS 2020 (single quadrupole) ESI : +4.7kV Scan range : 500-2000m/z Scan rate : 2pps

 

e. Pour une augmentation possible du débit sans variation significative de la résolution

Peptide Mapping : analyse d’apotransferrine (après digestion enzymatique) sur colonne Core Shell AMT Halo 160Å ES-C18 2.7µm

Condition du test Colonne : HALO 160Å ES-C18, 2.7μm – 2.1x100mm Phase mobile A : H2O/0.1% TFA Phase mobile B : 80% ACN/0.1% TFA Gradient : comme indiqué Débit : 0.5mL/min Température : 60°C Détection :215nm, PDA Volume d’injection : 15µLEchantillon apotransferrin tryptic digest

 

f. Pour une utilisation LC/MS pour des analyses très hautes résolutions de protéines ou de peptides

Caractérisation des chaines lourdes & légères d’anticorps monoclonaux (IgG1) sur colonne AMT Halo 400Å C4 3.4µm

Condition du test Colonne : HALO Protein 400Å C4, 3.4μm 100×2.1mm Phase mobile A : H2O avec 0.5% acide formique avec 20mM de formiate d’ammonium Phase mobile B : (45/45/10 ) ACN/IPA/phase mobile A Gradient : 29 à 32%B en 20min Débit : 0.2mL/min – Temp. : 80°C Echantillon : lgG1 réduit & alkylé solubilisé dans H2O 025% acide formique – Volume injection : 2μL of 2μg/μLAppareil : Shimadzu Nexera & LCMS-2020 (simple quadripole MS) Détection : 280nm & MS utilisant 2pps scan rate de 500 à 2000m/z Paramètres MS : Ionisation positive, ESI à +4.5kV, 400˚C heatblock